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色譜柱的使用和維護(hù)
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更新時(shí)間:2018-01-25
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色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要,稍有不慎就會(huì)降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操縱過(guò)程中,需要留意下列題目,以維護(hù)色譜柱。
?、佟”苊鈮毫蜏囟鹊募眲∽兓叭魏螜C(jī)械震動(dòng)。溫度的忽然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況;柱壓的忽然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料,因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行,在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過(guò)緩(如前所述)。
?、凇?yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成,特別是反相色譜中,不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬粗嗳弧?br />
?、邸∫话阏f(shuō)來(lái)色譜柱不能反沖,只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí),才可以反沖除往留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。
?、堋∵x擇使用適宜的活動(dòng)相(尤其是pH),以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱,分析柱是鍵合硅膠時(shí),預(yù)柱為硅膠,可使活動(dòng)相在進(jìn)進(jìn)分析柱之前預(yù)先被硅膠"飽和",避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。
?、荨”苊鈱⒒|(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注進(jìn)柱內(nèi),需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。
?、蕖〗?jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱,清除保存在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí),對(duì)流路系統(tǒng)中活動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過(guò)渡,每種活動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右,即常規(guī)分析需要50~75ml。
下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序,作為參考:硅膠柱以正已烷(或庚烷)、二氯甲烷和甲醇依次沖洗,然后再以相反順序依次沖洗,所有溶劑都必須嚴(yán)格脫水。甲醇能洗往殘留的強(qiáng)極性雜質(zhì),已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷(或氯仿)依次沖洗,再以相反順序依次沖洗。假如下一步分析用的活動(dòng)相不含緩沖液,那么可以省略zui后用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗往殘留的非極性雜質(zhì),在甲醇(乙腈)沖洗時(shí)重復(fù)注射100~200μl四氫呋喃數(shù)次有助于除往強(qiáng)疏水性雜質(zhì)。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除往類脂。有時(shí)也注射二甲亞砜數(shù)次。此外,用乙腈、丙酮和三氟醋酸(0.1%)梯度洗脫能除往蛋白質(zhì)污染。
陽(yáng)離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗,陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗,除往交換性能強(qiáng)的鹽,然后用水、甲醇、二氯甲烷(除往吸附在固定相表面的有機(jī)物)、甲醇、水依次沖洗。
?、摺”4嫔V柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)布滿乙腈或甲醇,柱接頭要擰緊,防止溶劑揮發(fā)干燥。盡對(duì)禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間。
⑧ 色譜柱使用過(guò)程中,假如壓力升高,一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞,這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗;另一種可能是大分子進(jìn)進(jìn)柱內(nèi),使柱頭被污染;假如柱效降低或色譜峰變形,則可能柱頭出現(xiàn)塌陷,死體積增大。
在后兩種情況發(fā)生時(shí),小心擰開(kāi)柱接頭,用潔凈小鋼將柱頭填料取出1~2mm高度(留意把被污染填料取凈)再把柱內(nèi)填料整平。然后用適當(dāng)溶劑濕潤(rùn)的固定相(與柱內(nèi)相同)填滿色譜柱,壓平,再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善,但是很難恢復(fù)到新柱的水平。
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